(一)细胞冻存
1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;
2.取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。
3.去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;
4.离心1000rpm,5min;
5.去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
6.将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5ml;
7.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
8.冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3.离心,1000rpm,5min;
4.弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;
5.次日更换一次培养液,继续培养。
注意事项
1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;
2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;
3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。